一、實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)設(shè)置
實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國(guó)家流感中心和省級(jí)流感實(shí)驗(yàn)室兩級(jí)組成。
二、實(shí)驗(yàn)室條件及生物安全操作的要求
1.省級(jí)流感實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件及生物安全的操作要求
(1)實(shí)驗(yàn)生物安全要求：安全Ⅱ級(jí)+(BSL-2級(jí)+)或安全Ⅲ級(jí)(BSL-3級(jí))。
(2)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)中用到的血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)可以在安全Ⅱ級(jí)+(BSL-2級(jí)+)實(shí)驗(yàn)室里操作。
(3)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測(cè)在安全Ⅱ級(jí)+(BSL-2級(jí)+)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里提取病毒的核酸，進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室要求請(qǐng)參照國(guó)家有關(guān)核酸檢測(cè)要求的規(guī)定。
(4)微量中和實(shí)驗(yàn)、特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性的采樣標(biāo)本的病毒分離、尸檢標(biāo)本的檢測(cè)必須在安全Ⅲ級(jí)(BSL-3級(jí))實(shí)驗(yàn)室里操作。
(5)省級(jí)流感實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件：具備進(jìn)行禽流感相關(guān)臨床標(biāo)本初篩所需的生物安全柜、離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、紫外線檢測(cè)儀等配套設(shè)備。
2.國(guó)家流感中心
實(shí)驗(yàn)生物安全要求：生物安全Ⅱ級(jí)+(BSL-2級(jí)+)和生物安全Ⅲ級(jí)(BSL-3級(jí))實(shí)驗(yàn)室。
3.省級(jí)流感實(shí)驗(yàn)室職責(zé)
(1)禽流感采樣標(biāo)本的臨床標(biāo)本特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測(cè)；
(2)禽流感H5的血清學(xué)檢測(cè)工作;
(3)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本的病毒分離必須在生物安全Ⅲ級(jí)(BSL-3級(jí))實(shí)驗(yàn)室；
(4)沒(méi)有生物安全Ⅲ級(jí)(BSL-3級(jí))實(shí)驗(yàn)室的，將標(biāo)本送國(guó)家流感中心做病毒的分離工作。
4.國(guó)家流感中心實(shí)驗(yàn)室職責(zé)
(1)國(guó)家流感中心設(shè)立在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所流感室；
(2)對(duì)各省報(bào)告的禽流感疑似病例或確診病例進(jìn)行復(fù)核、確認(rèn)；
(3)對(duì)不具備禽流感病毒分離條件的省份送檢標(biāo)本的檢測(cè)、分離和確認(rèn)；
(4)對(duì)需要做微量中和實(shí)驗(yàn)的血清標(biāo)本進(jìn)行微量中和試驗(yàn)；
(5)對(duì)各省級(jí)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員的培訓(xùn)；
(6)對(duì)各省級(jí)流感實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制。
三、原始標(biāo)本采集
1.標(biāo)本采集人員
醫(yī)療機(jī)構(gòu)的醫(yī)生、護(hù)士或當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心專業(yè)人員負(fù)責(zé)標(biāo)本采集并填寫(xiě)標(biāo)本登記表，標(biāo)本采集人員按照《禽流感職業(yè)暴露人員防護(hù)原則》做好個(gè)人防護(hù)。
2.標(biāo)本采集種類和時(shí)限
(1)采集標(biāo)本的種類：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。
(2)采集標(biāo)本時(shí)間：
1)咽、鼻拭子或含漱液在發(fā)病的頭3天采集；
2)急性期血清在發(fā)病后7天內(nèi)采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病后2-4周采集；
3)尸檢標(biāo)本尸檢時(shí)采集。
3.標(biāo)本的運(yùn)送：所有采集的標(biāo)本應(yīng)在醫(yī)院采集時(shí)立即分裝，一式二份，其中一份單獨(dú)保存，以備復(fù)核。采集的標(biāo)本若不能在24小時(shí)內(nèi)送達(dá)，則應(yīng)盡快在-70℃以下保存。無(wú)-70℃條件的需在-20℃冰箱短時(shí)間暫存，并盡快聯(lián)系遞送標(biāo)本。
4.標(biāo)本采集的方法：詳見(jiàn)國(guó)標(biāo)《流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》
四、送流感中心的標(biāo)本包裝、運(yùn)送與接收
1.標(biāo)本的包裝
(1)標(biāo)本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有橡膠圈的塑料管里，擰緊。
(2)將密閉后的標(biāo)本放入大小適合的塑料袋內(nèi)密封；每袋裝一份標(biāo)本。
(3)直接在塑料管上用油性記號(hào)筆寫(xiě)明樣本的種類、采樣時(shí)間、編號(hào)、姓名，同時(shí)也將標(biāo)本有關(guān)信息填在禽流感人體標(biāo)本送檢登記表，連同塑料管用另一塑料袋內(nèi)密封。
(4)將裝標(biāo)本的密封袋放入專用運(yùn)輸箱內(nèi)(或疫苗冷藏包)，放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內(nèi)襯具吸水和緩沖能力的材料。同一患者2份以上的密封標(biāo)本，可以放在同一個(gè)塑料袋內(nèi)再次做密封。若將進(jìn)行病毒分離，可將密封好的裝有標(biāo)本的容器直接放入液氮運(yùn)輸罐內(nèi)運(yùn)輸。所有容器必須印有生物危險(xiǎn)標(biāo)識(shí)。
2.標(biāo)本運(yùn)送
(1)航空或鐵路運(yùn)送。
(2)專人專車運(yùn)送：主要用于近距離樣品運(yùn)送。
3.標(biāo)本的接收
(1)各省級(jí)中心實(shí)驗(yàn)室應(yīng)公布標(biāo)本接收聯(lián)系方式，并實(shí)行24小時(shí)標(biāo)本接收制；
(2)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本接收：
需送國(guó)家流感中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的原始標(biāo)本、病毒分離物、可疑陽(yáng)性標(biāo)本、血清等，填寫(xiě)標(biāo)本送檢登記表，在低溫保存條件下，于24小時(shí)內(nèi)送至中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所流感中心進(jìn)行復(fù)核。國(guó)家流感中心標(biāo)本接收聯(lián)系方式為：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，地址：北京市宣武區(qū)迎新街100號(hào)，聯(lián)系人：郭元吉、王敏，聯(lián)系電話：010-63534632，010-63581337，傳真：(010)63534632。
五、標(biāo)本檢測(cè)方法
1.禽H5病毒核酸檢測(cè)：
材料：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。
方法：RT-PCR，用于禽H5亞型流感病毒的快速檢測(cè)、測(cè)序及排除工作試劑：特異性H5及甲型流感病毒的引物、病毒RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶等試劑,建議使用德國(guó)QIAGEN的Rneasy Mini Kit (病毒核酸提取)和QIAquick Gel Extraction Kit(PCR產(chǎn)物純化)產(chǎn)品。2.病毒分離及鑒定：
材料:疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。
方法：采用雞胚和MDCK細(xì)胞分離方法，血凝及血凝抑制試驗(yàn)(HAI)具體方法詳見(jiàn)國(guó)標(biāo)《流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》。經(jīng)特異性H5 RT-PCR病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性的采樣標(biāo)本的病毒分離及鑒定工作必須在安全Ⅲ級(jí)(BSL-3級(jí))實(shí)驗(yàn)室里操作。
試劑：雞胚接種采用SPF雞胚，MDCK細(xì)胞等。
3.疑似病例的血清學(xué)檢測(cè)：
材料：疑似病例的急性期和恢復(fù)期的雙份血清
方法：血凝抑制實(shí)驗(yàn)具體方法詳見(jiàn)國(guó)標(biāo)《流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》。
試劑：H5滅活病毒。
4.微量中和試驗(yàn)
材料：疑似病例的急性期和恢復(fù)期的雙份血清
試劑：H5活病毒，必須在生物安全Ⅲ級(jí)(BSL-3級(jí))實(shí)驗(yàn)室里操作。
六、檢測(cè)結(jié)果的確認(rèn)
以下情況的原始標(biāo)本及分離物送國(guó)家流感中心檢測(cè)、復(fù)核、確認(rèn)。
1.標(biāo)本分離物血凝實(shí)驗(yàn)(HA)陽(yáng)性，同時(shí)H5血凝抑制試驗(yàn)(HI)陰性，H5的RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性。
2.標(biāo)本分離物血凝實(shí)驗(yàn)(HA)陽(yáng)性，同時(shí)H5血凝抑制試驗(yàn)(HI)陽(yáng)性或H5的RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性。
3.標(biāo)本分離物血凝實(shí)驗(yàn)(HA)陽(yáng)性，同時(shí)H5的RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性。
4.病人恢復(fù)期血清比急性期血清的H5抗體有4倍或以上增高。
5.標(biāo)本分離陽(yáng)性，H5血凝抑制試驗(yàn)陰性，并已排除了是當(dāng)前流行的甲、乙型毒株的可能。
七、檢測(cè)結(jié)果報(bào)告
一般情況下,實(shí)驗(yàn)室收到的樣本立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并于收到標(biāo)本后24小時(shí)內(nèi)出具RT-PCR檢測(cè)報(bào)告，3-5天出具病毒分離培養(yǎng)結(jié)果，于分離到病毒后的3-5天出具流感病毒的血凝抑制結(jié)果，微量中和實(shí)驗(yàn)須3-5天完成。當(dāng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)不可預(yù)測(cè)情況或意外事件，影響了按時(shí)出具報(bào)告時(shí)，應(yīng)及時(shí)報(bào)告和說(shuō)明。
